Unidad 1 Técnicas y Métodos Neurobiológicos para el estudio de la relación entre cerebro y conducta.

 

 

Unidad 1 Técnicas y Métodos Neurobiológicos para el estudio de la relación entre cerebro y conducta.

 

Equipo: 1

Rosario Alcántara Guerra

Norma Leticia Alegria Torres

Verónica Álvarez Salazar

Muna Dora Buchahin Abulhosn

Luz Adriana Cadena Quiroz

 

Tutor: Gabriela Méndez Flores

Módulo 0203 Métodos de Evaluación en las Neurociencias del Comportamiento.

Semestre: 2015-2

Fecha: 10 de febrero de 2015

 

Ablación Experimental

Uno de los métodos de investigación para investigar las funciones cerebrales es la Ablación Experimental que es la extirpación o destrucción de una parte del encéfalo de un animal de laboratorio y las funciones que ya no puede ejecutar son las que controlaba previamente la región antes de ser destruida o extirpada. (Carlson, R. N., 2006, pág. 144).

Este método consiste la mayor parte de los casos en destruir algo del tejido y dejarlo en su sitio. (Carlson, R. N., 2006, pág. 145).

Es el método más antiguo utilizado en el campo de las neurociencias y sigue siendo de los más importantes. (Carlson, R. N., 2006, pág. 145).

 

Lesiones Cerebrales

 

Una lesión es una herida o un traumatismo, y un investigador que destruye una parte del cerebro por lo general describe al daño como una lesión cerebral. (Carlson, R. N., 2006, pág. 145).

Los experimentos en los que se daña parte del encéfalo y después se observa la conducta animal se llaman estudios de lesión. Su fundamento teórico es que el funcionamiento de  un área cerebral puede deducirse basándose en las conductas que el animal ya no puede realizar después de que se haya destruido dicha área. (Carlson, R. N., 2006, pág. 145).

 

 

El objetivo de descubrir cuáles son las funciones que realizan diferentes regiones cerebrales y luego entender cómo se combinan estas funciones para dar lugar a determinadas conductas. Los circuitos que hay en el encéfalo efectúan funciones, no conductas. Ninguna función cerebral o circuito neural es el único responsable de una conducta; cada región efectúa una función que contribuye a la ejecución de la conducta. (Carlson, R. N., 2006, pág. 145).

La tarea del investigador es comprender cuales son las funciones que se necesitan para llevar a cabo una conducta específica y determinar cuáles son los circuitos de neuronas cerebrales responsables de cada una de esas funciones. (Carlson, R. N., 2006, pág. 145).

Quienes sufren lesiones en el lóbulo parietal cuelen tener dificultades para hacer cálculos aritméticos. (Carlson, R. N., 2006, pág. 145).

 

 

Tipo de Lesiones

 

Lesiones por radiofrecuencia: lesión producida por el paso de una corriente de radiofrecuencia a través de los extremos de electrodos de acero inoxidable. (Carlson, R. N., 2006, pág. 146).

 

 

Lesión excitotóxica: Lesión cerebral producida por inyección intracarebral de un aminoácido excitatorio, tal como el ácido caínico. (Carlson, R. N., 2006, pág. 146).

Lesión falsa: Procedimiento placebo que produce todos los pasos de realización de una lesión cerebral salvo el que realmente causa. (Carlson, R. N., 2006, pág. 147).

Criodo: instrumento que produce lesiones temporales en la corteza cerbral. Instrumento se implanta quirúrgicamente entre el cráneo y el encéfalo, y la lesión puede producirse mientras el animal está despierto y alerta. Se hace circular líquido frio a través de los tubos de acero inoxidable. (Carlson, R. N., 2006, pág. 148).

 

 

Métodos histológicos.

 

Una vez que se ha producido la lesión cerebral y se han observado los efectos en la conducta del animal, se procede a seccionar y teñir el tejido cerebral a manera de que pueda ser analizado en el microscopio con la finalidad de localizar el lugar de la lesión. Se debe verificar la localización exacta del daño cerebral después de haber examinado el comportamiento animal. Para esto es necesario fijar, seccionar, teñir y examinar el encéfalo. Todos estos procedimientos en conjunto son llamados métodos histológicos.

 

Fijación y obtención de secciones.

Para lograr conservar el tejido en buenas condiciones se debe sumergir en un fijador. El más utilizado es la formalina la cual detiene la autolisis, endurece el tejido y elimina cualquier microorganismo que pudiera destruirlo.

 

                                         

 

Antes de colocar el encéfalo en la solución fijadora se debe perfundir, esto quiere decir que se debe extraer la sangre y sustituirla con otro líquido, esto con la finalidad de lograr mejores resultados histológicos. Se sacrifica al animal mediante una sobredosis de anestésico. Se abren los vasos sanguíneos para vaciar la sangre y se reemplaza por una solución salina. Se extrae el encéfalo del cráneo y se coloca en un recipiente con fijador.

Posteriormente el encéfalo se secciona en delgadas láminas y se tiñen diversas estructuras cerebrales para examinar su estructura pormenizadamente. Las secciones que se preparan para examinarlas en el microscopio óptico deben medir de 10 a 80 pm de grosor y las que se analizarán en un microscopio electrónico menos de 1 pm.

 

                                                 

Los cortes se realizan con la ayuda de un micrótomo éste consta de tres partes: una cuchilla, una plataforma en la que se coloca el tejido y un mecanismo que hace avanzar la cuchilla.

 

                                     

 

Después de haber cortado el tejido, las secciones se montan sobre portaobjetos de vidrio. Éstas pueden teñirse sumergiendo el portaobjetos en diversas soluciones químicas. Finalmente, las secciones teñidas se cubren con un poco de líquido transparente al cual se le llama medio de preparación y se coloca un cubreobjetos sobre ellas.

                                                        

 

 

Tinción.

 

Para lograr ver los detalles más finos en una sección del cerebro es necesario realizar tinciones histológicas específicas. Se han desarrollado varias tinciones diferentes pero en el caso del cerebro se utiliza una de las más simples: la tinción de somas celulares.

El material más utilizado para la tinción es el violeta de cresilo.

Mediante la tinción de somas celulares es posible identificar masas nucleares en el encéfalo. La tinción no tiñe selectivamente los somas celulares más bien todas las células por  lo que el investigador se dará a la tarea de identificar cada parte mediante su tamaño, forma y localización. 

                               

 

 

IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA

(Técnica de Golgi)

Es un procedimiento histolico que revela la morfología neuronal completa en tres dimensiones.

Se Fundamenta en la formación de depósitos opacos intracelulares de cromato argénico, producto de la reacción entre el bicromato de potasio y el nitrato de  plata (reacción negra).

Descubridor. Camilo Golgi y Santiago Ramón y Cajal.

El perfeccionamiento de las técnicas histológicas ha estado asociado con los avances en la micros-copía. Desde su aparición, la técnica de Golgi ha jugado un papel importante debido a la necesidad de desarrollar microscopios que mostraran con fidelidad la calidad de las imágenes tridimensionales de las neuronas impregnadas y sus ramificaciones más finas

Golgi fue defensor de la teoría reticular, la cual propone que el sistema nervioso estaba conformado por una red de células fusionadas a través de los axones a manera de un sincitio. También se debe a Golgi el descubrimiento del organelo celular conocido como “Aparato de Golgi”

Cajal defensor de la doctrina neuronal, sostenía que las neuronas eran células independientes.

 

Impregnaciones metálicas (argénticas)

Se denomina impregnación metálica a la precipitación de un metal (plata) reducida sobre las fibras reticulares y otros elementos determinados de los tejidos. El metal entra en contacto con los tejidos bajo la forma de solución salina; la reducción es debida en parte a la acción propia del tejido y a la de sustancias reductoras utilizadas en cada técnica o a agentes físicos como la luz. El metal forma un compuesto metal-orgánico para sensibilizar el tejido y luego la plata reemplaza ese metal. La plata amoniacal es la que impregna las fibras reticulares. Ese metal sensibilizante puede ser una solución de nitrato de uranilo (Técnica de Wilder), de nitrato de plata diluida (Técnica de Gridley) o de aluminio férrico (Técnica de Gomori).

    Técnicas de impregnación con Plata. Principios: En estas técnicas la sal de plata más empleada es el nitrato de plata, de allí que esta operación se denomina también nitratación.

Con esta técnica se impregnan dos tipos de elementos:

• Las fibras reticulares de la MEC que rodean células y vasos para poner en evidencia los límites de los elementos celulares obteniéndose una imagen negativa de estos últimos.

• Los elementos citológicos (núcleo, aparato de Golgi) y elementos nerviosos los cuales dan una imagen positiva.

    Las técnicas para fibras reticulares esencialmente son de dos tipos: 1) En cortes congelados, los cuales derivan del método tanno-argéntico de Achucarro (1911) y 2) Las derivadas de la técnica de Bielchowsky (1904) para cortes congelados o en parafina.

    El número de variantes derivadas de las técnicas madres son numerosas.

METODOS DE IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA.

Son clasificados en dos grandes grupos, partiendo del tipo de solución al que se exponen los tejidos para lograr la impregnación. De esta manera, tenemos métodos de plata amoniacal y de metenamina plata.

1) Métodos de Plata Amoniacal: Todos los métodos de plata amoniacal, tienen los siguientes pasos principales: Oxidación, sensibilización, exposición a la solución de plata, reducción, tonificación, remoción de la plata que no ha reaccionado y la coloración de contraste.

    Muchos de los métodos de plata amoniacal tienen mecanismos similares(11,12). Todos utilizan como base la solución de Bielchowsky que se prepara precipitando 20cc de nitrato de plata al 5% con 5 gotas de hidróxido de sodio al 40%. Luego se redisuelve el precipitado resultante añadiendo gota a gota amoníaco y se completa con agua destilada hasta obtener un volumen total de 40cc.

La Oxidación de los tejidos sirve para amplificar la subsecuente tinción de las fibras reticulares. Los oxidantes pueden variar de acuerdo a las técnicas. Los lavados, luego de la oxidación sirven para remover el exceso de reactivo.

El paso de sensibilización es básicamente una impregnación con una sal metálica que forma compuestos orgánico-metálicos con el tejido y luego este metal sensibilizado es reemplazado por la plata de la solución de nitrato de plata.

    Posteriormente, los tejidos son tratados con la solución de plata amoniacal. Usualmente, no hay cambios de color hasta que las secciones realmente se hayan reducido. Este proceso de reducción es comúnmente denominado revelado, y las técnicas de plata-diamina requieren concentraciones variables de formalina (formaldehido HCHO) como agente reductor.

La plata metálica visible que resulta del proceso de reducción puede ser marrón o negra, dependiendo de la cantidad de plata y del tamaño de las partículas. Estos depósitos pueden ser tonalizados convirtiéndolos en depósitos de oro metálico que son púrpura negros, al tratarlos con cloruro de oro (AuCl3). El oro metálico es mucho más estable que la plata metálica, y los cortes tratados con esta solución muestran un mejor contraste y claridad que los que no han sido tratados con la solución.

 

El tratamiento final de la sección para su contraste es la inmersión de las láminas en una solución de tiosulfato de sodio que forma complejos solubles con la plata iónica que no ha reaccionado con el tejido. Esta remoción de la plata no reactiva previene una tardía reducción no específica de la plata con la luz, al igual que remueve el exceso de cloruro de oro que pueda estar presente en el tejido.

2) Métodos de metenamina de plata: Los métodos de metenamina de plata de Jones y Gomori, están basados en la producción de grupos aldehidos a partir de los grupos a-glicol de los carbohidratos presentes en las fibras reticulares y en las membranas basales luego de la exposición de los tejidos a una solución de ácido peryódico. Estos aldehidos se reducen con los complejos de metenamina de plata dando como resultado plata metálica visible. El cloruro de oro y el tiosulfato de sodio, son usados en estos métodos y cumplen las mismas funciones que en las impregnaciones de plata amoniaca.

 

HINMUNOHISTOQUÍM

 

La inmunohistoquímica es una técnica basada en la tinción de tejido fijado e incluido en parafina, procedente de biopsias de ganglios linfáticos, médula ósea y otros tejidos hematopoyéticos, con anticuerpos específicos marcados con una enzima que torna visible un sustrato invisible.

El complejo antígeno-anticuerpo se identifica en el tejido mediante microscopia, localizándolo allí donde se ha unido a moléculas específicas presentes en las células del tejido en estudio.

La inmunohistoquímica, también llamado marcaje inmunohistoquímico, se utiliza comúnmente en diferentes tipos de aplicaciones tales como:

Diagnóstico de células anormales presentes por ejemplo, en diferentes estadios de enfermedades (cáncer, entre otras), el desarrollo de fármacos y la investigación biológica. Los biomarcadores específicos son característicos de cada evento celular, tal como la proliferación o la apoptosis, que son las causas de la anormalidad celular.

El desarrollo de fármacos para evaluar la eficacia del fármaco, la detección de la variación de la actividad de las dianas de cada enfermedad.

La investigación biológica para conocer la ubicación y la colocalización de una proteína dentro de las diferentes partes de una célula (núcleo, citoplasma o membrana, etc.)

Mientras que el uso de anticuerpos adecuados para dirigirse específicamente a los antígenos correctos y amplificar la señal, es importante para la visualización de los antígenos, una preparación completa y correcta de la muestra es un paso importante para mantener la morfología celular, la arquitectura del tejido y la antigenicidad de los epítopos diana. Esto requiere una recolección adecuada de tejido, perfusión, fijación del tejido, inclusión y corte, etc.

Las técnicas más usadas son las de inmunohistoquímica indirecta, con polímeros conjugados con anticuerpos y agentes reveladores, y las técnicas de inmunofluorescencia directa. La mayor parte de los métodos que utilizamos están automatizados mediante sistemas de tinción robotizados que aplican los anticuerpos específicos previamente seleccionados y el resto de reactivos sobre las distintas preparaciones de los cortes de tejidos.

Se llevan a cabo también técnicas moleculares diagnósticas como las basadas en hibridación in situ (FISH, SISH) para la detección de alteraciones moleculares —amplificaciones, traslocaciones, deleciones— y presencia de algunos tipos de virus. Se usan técnicas basadas en PCR y electroforesis para el estudio de diversas mutaciones.

 

Métodos Neuroquímicos

Una lesión es una herida o un traumatismo, y en este caso el daño se describe como lesión cerebral.

La ablación experimental es uno de los principales métodos de investigación para estudiar las funciones cerebrales. Esta técnica requiere destruir algo de tejido del encéfalo y evaluar la conducta subsecuente del animal. Estos estudios se denominan “estudios de lesión.” Su objetivo es descubrir las funciones que realizan las diferentes regiones cerebrales y luego entender cómo dan lugar a determinadas conductas.

Es importante distinguir entre función cerebral y conducta, ya que los circuitos del encéfalo hacen funciones, no conductas. Cada región efectúa una o varias funciones que contribuyen a la ejecución de la conducta.

La neuroquímica nos muestra un enfoque molecular de la función nerviosa al identificar los procesos de comunicación entre moléculas y células.

 

La localización en el cerebro de un determinado neurotransmisor o de un receptor  es el primer paso para comprender su función psicológica. Para ello existen dos técnicas: la inmunocitoquímica y la hibridación in situ, que suponen la exposición de las secciones del cerebro de una a otra molécula.

La inmunocitoquímica, es un procedimiento para localizar determinadas neuroproteínas en el cerebro por medio de tinción de los anticuerpos y exposición de las secciones marcadas. Cuando una proteína o antígeno extraño se inyecta a un animal, este produce anticuerpos que unidos a la proteína ayudan al cuerpo a destruir ese antígeno. A esto se le llama reacción inmune.

 

La hibridación in situ es la técnica que permite la localización de péptidos y otras proteínas cerebrales, a partir de secuencias que dirigen la síntesis de muchos neuropéptidos. Sus pasos son: obtener las hileras de ARN híbrido con la secuencia complementaria de la síntesis de la neuroproteína; posteriormente, se marcan las hileras con un tinte radiactivo y las secciones cerebrales se exponen señalando la localización de las neuronas que liberan la neuroproteína de interés.

 

Localización de neurotransmisores y receptores.

     Como anteriormente hemos visto en neurociencias, los neurotransmisores, transmiten información de una neurona a otra, dentro de  ese proceso, intervienen los receptores, los cuales recogen la información. Para comprender mejor las funciones psicológicas es necesario saber dónde están localizados los neurotransmisores y receptores.

     Existen dos técnicas que se disponen para lo mismo: la inmunocitoquímica y  la hibridación in situ.

     La inmunocitoquímica: localiza las neuroproteinas en el cerebro,  formadas por las partes cerebrales que tienen mayor radioactividad y acumulación de tinte. Localiza los neurotransmisores por medio de la unión de proteínas (enzimas); algunas neuronas poseen un determinado neurotransmisor,  que es liberado y esto hace que esas neuronas cuenten con la cantidad necesaria de enzimas para su síntesis. Para que esto suceda, primero se expone una parte cerebral a los anticuerpos marcados, los cuales se unen a la enzima de las neuronas que tienen el neurotransmisor que nos interesa localizar.
Los neuroquímicos han fabricado anticuerpos para los neurotransmisores y receptores cerebrales.

     La hibridación: esta técnica localiza los péptidos u las proteínas cerebrales, las cuales se transcriben  en las hileras del ARN mensajero, en secuencias de bases nucleótidas. La hibridación requiere de una serie de pasos:

Primero: se debe conseguir las hileras de ARN híbrido, con las bases complementarias del ARNm, estas bases deben  dirigir la síntesis de la neuroproteína que nos interesa, localizar.
Segundo:   Las hileras de ARN híbrido se marcan con un tinte o radioactividad.
Tercero: las secciones cerebrales se manifiestan en  las hileras del ARN híbrido que se marcó, posteriormente se unen a las hileras de ARNm complementario, de tal forma que señalan la localización de las neuronas que liberan la proteína que nos interesa.

     Agrego un mapa conceptual con los datos más importantes de lo antes mencionado.

 

 

 

 

 

Bibliografía

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Imagen 1: http://psicologiafisiologica.wikispaces.com/file/view/rata.jpg/337674038/rata.jpg

Imagen 2: http://www.mapfre.com/fundacion/html/revistas/trauma/v20n4/img/fotos/02_06_02.jpg

Imagen 3: http://www.curiosasnoticias.com/wp-content/uploads/2011/07/rata-perdida.jpg

Imagen 4: http://robertcabre.files.wordpress.com/2012/02/ratas.jpg

Bibliografia:

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Imagen 10: http://www.nitzipper.com/es/nitzipper-aplicaciones-ioconjugacion/inmunohistoquimica.html